01/12/2013

O que é a Cromatografia?

01/12/2013 às 02:36:00

Segundo a International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC), "a cromatografia é uma técnica utilizada na separação dos componentes de uma amostra, os quais se distribuem em duas fases, uma estacionária e a outra móvel. A fase estacionária pode ser um sólido, um líquido retido sobre um sólido, ou um gel. A fase móvel pode ser líquida ou gasosa.

O que é a fase estacionária e a fase móvel?
Bom, os nomes são auto-explicativos, mas tentarei exemplificar mais. Por hora esqueça os componentes da mistura que você quer separar e pense no sistema. A "parte" fixa é a fase estacionária e o eluente ("parte" móvel) é a fase móvel. De acordo com a polaridade dos componentes da sua amostra, eles ou interagirão mais com a fase estacionária ou com a fase móvel (na maioria das vezes mais apolar que a fase estacionária).

A fase estacionária possui conceitos previamente estabelecidos, ou seja, se essa fase for mais polar que a fase móvel ela é chamada de fase normal (nessa fase é muito utilizada a sílica gel, alumina e celite). Se a fase estacionária for mais apolar que a fase móvel é chamada de fase reversa (fase estacionária quimicamente ligada). Dessa forma, dependendo da fase estacionária que está sendo utilizada, a substância mais retida ou é mais polar ou mais apolar. Na figura 1 temos um exemplo utilizando a CCD.


Figura 1:  Cromatograma obtido por CCD no qual se pode observar a diferença de afinidade das 
substâncias 1 e 2 pela fase estacionária. Considerando o uso da sílica gel como fase estacionária, a 
substância 1 ficou mais retida, isso significa que ela é mais polar que a substância 2, que por sua vez 
conseguiu uma distância maior devido a sua menor interação com a fase estacionária. 


O que é eluição? O que é um eluente?
Eluição é a corrida cromatográfica propriamente dita.

Já o eluente "pode" ser pensado como um tipo de solvente, entretanto, ele não vai dissolver ou reagir com as amostras, e sim, interagir com elas. Ele é a fase móvel e por isso, promove a separação dos componentes.

O que são as fases estacionárias quimicamente ligadas?
As fases estacionárias quimicamente ligadas são as fases mais importantes da cromatografia líquida. Obtidas pela reação dos grupos silanóis da sílica com compostos contendo grupos polares (Fase Normal) ou apolares (Fase Reversa).

Na Fase Quimicamente Ligada, a sílica gel, através dos grupos Si - OH se liga quimicamente a um grupo funcional que lhe confere grande estabilidade química. Este grupo pode ser polar como por exemplo, NO2, CN, NH2... ou apolar como n-alquil, n-aril... obtendo-se uma fase monomérica ou polimérica. Dentro deste último grupo temos as colunas conhecidas como C8 e C18 (ou RP 8 e RP 18) responsáveis pela maioria das separações em fase reversa. A figura 2 apresenta um esquema de uma colunda C18.

Figura 2: Fase reversa C18.


Para quê a cromatografia é utilizada, de forma geral?
A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de compostos, por comparação com padrões previamente existentes; para a purificação de compostos, separando-se as substâncias indesejáveis; e para a separação dos componentes de uma mistura.

Quais os tipos de cromatografia?
As diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas considerando-se diversos critérios.


1. Em relação à forma física do sistema:
Nesse caso, a cromatografia pode ser subdividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar.

Enquanto a cromatografia planar resume-se à cromatografia em papel (CP), à cromatografia por centrifugação (Chromatotron) e à cromatografia em camada delgada (CCD) também chamada de cromatografia em camada fina (CCF), são diversos os tipos de cromatografia em coluna, os quais serão mais bem compreendidos quando classificados por outro critério.

2. Em relação à fase móvel empregada:
Em se tratando da fase móvel, são três os tipos de cromatografia: a cromatografia gasosa (CG), a cromatografia líquida e a cromatografia supercrítica (CSC), usando-se na última um vapor pressurizado, acima de sua temperatura crítica. A cromatografia líquida apresenta uma importante subdivisão: a cromatografia líquida clássica (CLC), na qual a fase móvel é arrastada através da coluna apenas pela força da gravidade, e a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), na qual se utilizam fases estacionárias de partículas menores, sendo necessário o uso de uma bomba de alta pressão para a eluição da fase móvel. A CLAE foi inicialmente denominada cromatografia líquida de alta pressão, mas sua atual designação mostra-se mais adequada. No caso de fases móveis gasosas, separações podem ser obtidas por cromatografia gasosa (CG) e por cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR). A diferença entre os dois tipos está na coluna. Enquanto na CGAR são utilizadas colunas capilares, nas quais a fase estacionária é um filme depositado na mesma, a CG utiliza colunas de maior diâmetro empacotadas com a fase estacionária.

Quais os tipos de fase estacionária?
A fase estacionária distingue-se entre fases estacionárias sólidas, líquidas e quimicamente ligadas. No caso da fase estacionária ser constituída por um líquido, este pode estar simplesmente adsorvido sobre um suporte sólido ou imobilizado sobre ele. Suportes modificados são considerados separadamente, como fases quimicamente ligadas, por normalmente diferirem dos outros dois em seus mecanismos de separação.

Modos de Separação:
Separações cromatográficas se devem à adsorção, partição, troca iônica, exclusão ou misturas desses mecanismos.

Para se ter uma visão mais ampla dos diferentes tipos de cromatografia, os mesmos estão dispostos no diagrama da Figura 3.

Figura 3: Representação esquemática dos diferentes tipos de cromatografia.

Cromatografia Planar
1. Cromatografia em Papel (CP)
A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição líquido–líquido, estando um deles fixado a um suporte sólido. Baseia-se na diferença de solubilidade das substâncias em questão entre duas fases imiscíveis, sendo geralmente a água um dos líquidos. O solvente é saturado em água e a partição se dá devido à presença de água em celulose (papel de filtro). Este método, embora menos eficiente que a CCD, é muito útil para a separação de compostos polares, sendo largamente usado em bioquímica.

2. Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ou Cromatografia em Camada Fina (CCF)
A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica de adsorção líquido–sólido. Nesse caso, a separação se dá pela diferença de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionária.

O parâmetro mais importante a ser considerado em CCD (acompanhe a figura 1) é o fator de retenção (Rf), o qual é a razão entre a distância percorrida pela substância em questão e a distância percorrida pela fase móvel. Os valores ideais para Rf estão entre 04 e 06.

Fases estacionárias mais utilizadas: Sílica gel, alumina, terra diatomácea e celulose.
Fases móveis: A escolha da fase móvel, que geralmente é constituída por um ou mais solventes, não é tarefa simples. No entanto, uma vez que as fases estacionárias mais usadas são extremamente polares, não devem ser utilizados solventes pouco polares, que não removeriam os compostos do ponto de aplicação, nem solventes muito polares, capazes de arrastar os componentes da amostra até o topo da placa. Em vista disso, melhores resultados são obtidos com misturas de solventes, de modo a se obter uma polaridade média em relação à polaridade dos componentes da amostra.

Ao ascender, o solvente irá arrastar mais os compostos menos adsorvidos (que interagiram menos) na fase estacionária, separando-os dos mais adsorvidos. A linha de chegada da fase móvel deve ser marcada e a placa deve estar seca. Como a maioria dos compostos orgânicos é incolor, faz-se necessária a utilização de um processo de revelação para que se possa analisar o resultado.

Cromatografia em Coluna
1. Cromatografia Líquida Clássica
Esta técnica é muito utilizada para isolamento de produtos naturais e purificação de produtos de reações químicas. As fases estacionárias mais utilizadas são sílica e alumina, entretanto estes adsorventes podem servir simplesmente como suporte para uma fase estacionária líquida. Fases estacionárias sólidas levam à separação por adsorção e fases estacionárias líquidas por partição. Suportes quimicamente modificados também têm sido usados, sendo o processo de separação misto neste caso.

Figura 4: Ilustração de uma coluna cromatográfica.
Esses suportes são acondicionados em tubos cilíndricos geralmente de vidro, de diâmetros variados, os quais possuem uma torneira em sua extremidade inferior. A Fig. 4 é uma ilustração de uma coluna cromatográfica empacotada com sílica, sendo mostrados seus demais constituintes.

Os adsorventes possuem partículas na faixa de 60-230 mesh (unidade de medida de malha de peneiras; quanto maior no número, menor o tamanho do furo e portanto menor a granulometria do material peneirado), de modo a possibilitar um fluxo razoável do solvente através da coluna.

O uso de sílica de partícula menor (230-400 mesh) como adsorvente para essas colunas requer a utilização de um sistema de bombeamento para o empacotamento e eluição, sendo conhecido como Cromatografia Flash.

A principal etapa ao se utilizar essa técnica é o empacotamento, o qual, entre outros fatores, definirá a eficiência da separação. Enquanto a alumina é empacotada em sua forma original, a sílica deve sê-lo na forma de suspensão.

Após o empacotamento, é conveniente que se passe uma certa quantidade do eluente (duas a três vezes o volume da coluna) a ser utilizado através da coluna antes da introdução da amostra. Esta é adicionada à coluna com o auxílio de uma pipeta no momento em que o nível do eluente esteja o mais próximo possível do adsorvente. Esse procedimento ameniza o alargamento das bandas a serem eluídas. Tendo a amostra penetrado no adsorvente, o eluente é então adicionado cuidadosa e continuamente.

A escolha do eluente segue os princípios discutidos em CCD, mas neste caso ele pode ser mudado durante o processo cromatográfico. Se, por exemplo, a amostra é constituída por duas substâncias, uma apolar e outra polar, utiliza-se primeiramente um eluente apolar e em seguida um eluente polar.

O volume das frações a serem recolhidas é função da quantidade de amostra e do grau de dificuldade da separação. Para análise das mesmas, recorre-se a alguma técnica auxiliar, usualmente CCD.

Em vista de que geralmente algumas partículas da amostra permanecem irreversivelmente adsorvidas à fase estacionária, a cada separação é necessário um tratamento para a recuperação do adsorvente.

2. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
O grande avanço na cromatografia em coluna foi o desenvolvimento e a utilização de suportes com partículas diminutas responsáveis pela alta eficiência, as quais tornam necessário o uso de bombas de alta pressão para a eluição (corrida cromatográfica propriamente dita) da fase móvel, devido a sua baixa permeabilidade. A Fig. 5 mostra um equipamento típico de CLAE.

Figura 5: Equipamento básico de CLAE. a) reservatório da fase móvel; b) bomba de alta pressão; c) válvula de injeção; d) coluna; e) detector e f) registrador.

As fases móveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxigênio ou outros gases dissolvidos, sendo filtradas e desgaseificadas antes do uso.

A bomba deve proporcionar ao sistema vazão contínua sem pulsos com alta reprodutibilidade, possibilitando a eluição da fase móvel a um fluxo adequado.

As válvulas de injeção usadas possuem uma alça de amostragem para a introdução da amostra com uma seringa e duas posições, uma para o preenchimento da alça e outra para sua liberação para a coluna.

As colunas utilizadas em CLAE são geralmente de aço inoxidável, com diâmetro interno de cerca de 045 cm para separações analíticas e na faixa de 2,2 cm para preparativas. O comprimento é variável, sendo comuns colunas analíticas de 10-25 cm e preparativas em torno de 25-30 cm. Essas colunas são reaproveitáveis, sendo empacotadas com suportes de alta resolução, não sendo necessária sua regeneração após cada separação.

O detector mais utilizado para separações por CLAE é o detector de ultravioleta, sendo também empregados detectores de fluorescência, de indíce de refração, e eletroquímicos, entre outros. Detectores de polarimetria para CLAE, recentemente desenvolvidos, diferenciam compostos quirais, através da rotação de seus estereoisômeros frente à luz plano-polarizada.

O registro de dados pode ser feito através de um registrador, um integrador ou um microcomputador.

Figura 6: Cromatograma mostrando a separação
dos enantiômeros do tetramisol, princípio ativo de vários
medicamentos usados para ascaridíase.
A Fig. 6 ilustra uma separação enantiomérica por CLAE.

A versatilidade desta técnica reside no grande número de fases estacionárias existentes, as quais possibilitam análises e separações de uma ampla gama de compostos com alta eficiência. Tem sido utilizada em várias áreas da ciência, no acompanhamento de sínteses, em análises de pesticidas, feromônios, no isolamento de produtos naturais e sintéticos e na produção e controle de qualidade de medicamentos, dentre tantas outras aplicações.

As separações em CLAE podem se dar por adsorção, partição ou ambos. O suporte mais comumente utilizado é a sílica. O uso de fases estacionárias líquidas adsorvidas a um suporte não tem grande aplicação devido à perda de fase estacionária, mas o uso de suportes modificados, os quais foram desenvolvidos como conseqüência do problema acima, possibilita a produção de uma imensa variedade de colunas com diferentes propriedades e tipos de seletividade. As fases assim obtidas são chamadas de quimicamente ligadas.

Essas fases, dependendo da modificação feita ao suporte, podem atuar no modo normal, reverso ou ambos (modos discutidos no tópico "o que é a fase estacionária e a fase móvel" deste post).

Separações analíticas são predominantemente realizadas em fase reversa, sendo a fase C18 (octadecilsílica) a mais usada, ao passo que são preferidas fases que atuem no modo normal para fins preparativos, em vista de que separações no modo reverso utilizam fases móveis aquosas.

Entre as fases quimicamente ligadas, merecido destaque deve ser dado às fases estacionárias quirais, as quais possibilitam a separação direta de enantiômeros. Para tanto, é necessária a presença de um seletor quiral como parte integrante da fase estacionária.

3. Cromatografia Gasosa
A cromatografia gasosa é um método físico de separação dos componentes de uma mistura através de uma fase gasosa móvel (gás inerte) sobre um solvente estacionário. A cromatografia gasosa é utilizada para a separação de compostos voláteis, isto é, os analitos (soluções a serem analisadas) a serem separados devem apresentar uma razoável pressão de vapor à temperatura de separação, uma vez que a coluna é colocada dentro de um forno, o que exige estabilidade térmica da amostra. Durante a análise, a temperatura da coluna pode permanecer constante ou sofrer uma variação que pode alcançar cerca de 300ºC, para que solutos de baixo ponto de ebulição possam ser eluídos. Dessa forma, quanto maior for o caráter iônico do composto, menor será sua volatilidade o que reduzirá também a possibilidade de separação via CG. Por outro lado, na cromatografia líquida separam-se compostos polares e não polares nos quais a pouca volatilidade não é inconveniente limitante.


4. Cromatografia Gasosa de Alta Resolução

Em contraste à CLAE, o principal mecanismo de separação da cromatografia gasosa está baseado na partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel gasosa e a fase estacionária líquida. A utilização de fases estacionárias sólidas, as quais levariam à separação por adsorção, apresenta poucas aplicações.

A cromatografia gasosa é uma das técnicas analíticas mais utilizadas. Além de possuir um alto poder de resolução, é muito atrativa devido à possibilidade de detecção em escala de nano a picogramas (10–9 - 10-12 g). A grande limitação deste método é a necessidade de que a amostra seja volátil ou estável termicamente, embora amostras não voláteis ou instáveis possam ser derivadas quimicamente. Pode ser utilizada para separações preparativas apenas na faixa de microgramas a miligramas, não sendo muito empregada para esse fim. A Fig. 7 mostra os componentes básicos de um cromatógrafo gasoso.

Figura 7: Componentes básicos de um cromatógrafo gasoso. a) cilindro do gás de arraste mantido sob alta pressão; b) injetor; c) coluna; d) detector e e) registrador.
Como dito anteriormente, a diferença entre CG e CGAR está na coluna. Colunas de CGAR são maiores em comprimento, menores em diâmetro, possuem a fase líquida como um filme aplicado diretamente às paredes do tubo da coluna e são mais eficientes.

Essas colunas são tubos longos de metais como aço ou cobre, vidro ou teflon. Colunas de CG têm diâmetro de cerca de 3 mm e comprimento em torno de 3 m, ao passo que colunas de CGAR têm diâmetro na faixa de 015-0,75 mm e comprimentos variados, usualmente entre 10 m e 100 m.

Os gases utilizados como fase móvel devem ter alta pureza e ser inertes em relação à fase estacionária. Hidrogênio, nitrogênio e hélio são os mais usados.

A injeção da amostra é feita através de microsseringas ou válvulas semelhantes às utilizadas em CLAE.

Os detectores de maior aplicação são o detector por ionização em chama e o detector de condutividade térmica. Os dados podem ser obtidos através de um registrador potenciométrico, um integrador ou um microcomputador, sendo as amostras identificadas por seus tempos de retenção.

Nesses equipamentos é necessário o controle da temperatura do injetor, da coluna e do detector, as quais são mantidas por termostatos. Como a temperatura é um fator extremamente importante, grande parte das análises por cromatografia gasosa é feita com programação de temperatura, obtendo-se melhor separação com picos mais simétricos em menor tempo.

Para o empacotamento de colunas de CG, geralmente empregam-se terras diatomáceas como suporte. A escolha da fase estacionária é de fundamental importância, sendo ela o componente crítico da coluna. As fases estacionárias podem ser polares, apolares ou quirais. Fases polares são baseadas em polietileno glicol puro ou modificado e apolares em metilsiloxano puro ou modificado. As fases quirais mais comuns são compostas de ciclodextrinas.

Atualmente, espectrômetros de massa têm sido acoplados a equipamentos de cromatografia gasosa, possibilitando a identificação imediata das substâncias presentes na amostra.

Questionário:
Pra terminar, temos um questionário da apostila de cromatografia da UFF (uma das fontes deste post). Sei que alguns dos assuntos das perguntas não foram abordados durante essa publicação, tentarei então exemplificar ao máximo as respostas.

1. Que características devem apresentar as amostras separadas por cromatografia gasosa?
As amostras separadas por CG devem ser voláteis, estáveis termicamente na temperatura de trabalho e apresentar baixo peso molecular. A cromatografia gasosa apresenta dificuldade em analisar substâncias não voláteis, que se decompõem em altas temperaturas ou possuem elevado peso molecular.

2. Que características devem apresentar as amostras separadas por HPLC?
A amostra deve ser solúvel na fase móvel, sendo ela líquida (iônica ou covalente) ou sólida (iônica ou covalente).

3. Quais as limitações que a cromatografia gasosa e HPLC apresentam?
Enquanto a CG é mais rápida e 10x mais eficiente que o HPLC, ela é pobre em capacidade preparativa e possui menor sensibilidade (10^-12 g DIC/DCE). O HPLC possui boa capacidade preparativa e sensibilidade igual a 10^-9 g (UV) e 10^-15 g (coulométrico).

4. Quais são os principais componentes de um equipamento de HPLC?
Reservatório da Fase Móvel, bomba, injetor, pré-coluna, coluna, detector e computador.

5. Qual o grau de pureza da fase móvel usada na técnica de HPLC?
O grau de pureza deve ser maior que 99,9%.

6. Por que é necessário filtrar e desgaseificar o eluente? 
As fases móveis, principalmente as polares, tem tendência a dissolver oxigênio e outros gases. Quando estes gases são liberados, dentro do equipamento, formam bolhas que podem afetar o funcionamento do detector e a eficiência da coluna. Desta forma é necessário remover os gases dissolvidos na fase móvel. Muitos equipamentos de HPLC já trazem a solução deste problema desgaseificando a fase móvel em um compartimento específico, antes que ela entre na bomba.

7. Qual é a função da pré-coluna?
O uso de pré-colunas é de importância vital para a vida útil da coluna analítica. A filtração da fase móvel e da amostra nem sempre são suficientes para a eliminação de impurezas prejudiciais à coluna. Dependendo das características da fase estacionária e da natureza da amostra, pode acontecer o que se chama de "retenção irreversível", ou seja, a afinidade do contaminante pela coluna é tão grande que ele não elui, ficando retido nos primeiros centímetros do empacotamento. Retido na cabeça da coluna, o contaminante pode provocar perda da eficiência, aumento de pressão e cauda nos picos. Com o uso da pré-coluna, o contaminante não atingirá a coluna analítica. Ao perceber os sintomas de contaminação (os mais comuns são aumento de pressão e elevação no nível de ruído), o analista substitui a pré-coluna, que em média custa 10 vezes menos que a coluna analítica.

8. Qual a diferença entre as separações cromatográficas com bombeamento isocrático e de gradiente?
No bombeamento isocrático a composição da fase móvel permanece constante, e é capaz de separar um número limitado de picos. Enquanto que no bombeamento gradiente a composição da fase móvel varia durante a análise. Aplica-se esse sistema quando a polaridade dos compostos é muito diferente e quando se separa amostras complexas.

9. Por que o detector de UV é o mais usado em HPLC?
Esses detectores apresentam como principal atrativo o fato de se poder escolher diferentes comprimentos de onda. Permitem a análise de amostras complexas que absorvem em diferentes comprimentos de onda; assim como permitem a obtenção do espectro completo de um pico cromatográfico eluído da coluna

10. Qual a diferença entre cromatografia em fase normal e fase reversa?
Na fase normal a fase estacionária é mais polar que a fase móvel, enquanto que na fase reversa a fase estacionária é menos polar que a fase móvel.

11. A técnica de HPLC só trabalha com cromatografia em fase normal?
Não. O HPLC em fase normal utiliza as fases estacionárias quimicamente ligadas que consistem em uma fase imóvel apolar e uma fase móvel de polaridade moderada.

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Fontes:
Introdução à cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE - HPLC). Apostila da Universidade Federal Fluminense (UFF) - Departamento de Química Orgânica. Apostila utilizada na disciplina de Química Orgânica Experimental I. Autoria: Luci Martins Viana (Professora Associada - GQO - UFF) e Priscila Alvares Pinto (Programa de Monitoria GQO/2012).

Cromatografia: Um breve ensaio. Autoria: Ana Luiza G. Degani, Quezia B. Cass, Paulo C. Vieira. Química Nova Interativa (QNINT) - Sociedade Brasileira de Química (SBQ). Originalmente publicado em Química Nova na Escola, n. 7, maio 1998. Edição: Leila Cardoso Teruya. Coordenação: Guilherme Andrade Marson.
Lucas

Tem vinte e um anos de idade e é o idealizador e designer do Química Suprema. É entusiasta na área de Divulgação Científica com ênfase nas Ciências Químicas e Farmacêuticas. Possui noções de linguagens de programação, e entende de Design Gráfico e manuseio de programas de edição. Em 2013 cursou Licenciatura em Química e em 2014 resolveu trocar para o curso de Farmácia. Estuda na UFF.


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